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　　手机买球官网INSTRUMENTAL ANALYSIS 看着色香味俱佳的各类食品饮料 ，心中充满了向往 ，三聚氰胺、瘦肉精、漂白馒头的 安全事件又让人倍感担心 ，液相色谱检测的报道激发了强烈的期待。下面一道走进液 相色谱分析的世界。 PART 8.1 高效液相色谱法概述 TWO OVERVIEW OF HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY 目录/CATALOG 01 高效液相色谱法简介 02 高效液相色谱法特点 INTRODUCTION OF CHROMATOGRAPHY CHA RACT ERIST ICS OF HIGH PERFORMA NCE LIQUID CHROMATOGRAPHY 03 高效液相色谱仪 04 高效液相色谱仪主要部件 HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY MAIN COMPONENTS OF HPLC 一、高效液相色谱法简介 高效液相色谱法是70年代初期发展起来的一种以液体为流动相的新色谱技术。它 是在经典色谱理论的基础上 ，引入气相色谱理论 ，采用高压泵、高效固定相和高 灵敏度检测器等新技术而建立的一种色谱分析法。 迄今 ，高效液相色谱法得到了快速发展 ，已广泛用于各个领域 。 《中国药典》 2000版2691种药品只有279项采用 HPLC分析 ，但2020版 中大多数都增加了 HPLC测定。 HPLC将成为未来多组分混合物分离分析的首选方法。 液相色谱填料和分离模式的快速发展极大的提高了HPLC的分离效能 ： 01 薄壳型填料 ，柱效仅每米1000~3000塔板数 ； 02 5~10μm球型和无定型微粒硅胶 ，每米5~6万理 论塔板数 ； 03 高度均匀甚至单分散1~3μm硅胶基质球形填料 ， 达15~30万理论塔板/ m； 04 新型分离模式和方法不断增加。 二、高效液相色谱法特点 1. 基本特点 （1）高压 ： （2）高速 ： 5 一般可达1 ～10 mL/min。 一般可达150 ～350×10 Pa。 （3）高效 ： 近来研究出许多新型固定相 ，使分离效率大大提高。 （4）高灵敏度 ： 进样量小一般几微升 ；检测器灵敏度高。 （5）适用范围广 ： 世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定 ，包括高沸点、热不稳定有机及生化试 样的分离分析。 2. HPLC 与 GC 的比较 （1）HPLC 与 GC 的共同点 色谱的基本理论一致、定性与定量分析的原理完全一样。 （2）HPLC与GC的不同点 比较项目 GC HPLC 流动相相态 气体 液体 色谱基本类型 吸附色谱 吸附、分配、离子、 （依据分析原理） 分配色谱 交换、凝胶色谱等 可选色谱相 只能选择固定相 流动相和固定相 样品的回收 一般不易回收 可分级和定量回收 分离环镜(柱温\压力) 高温\常压 常温\高压 约 占20%有机物 ，气体、 约 占80%有机物 ，沸点高、 适宜分析的样品 易挥发、热稳定性好物质 极性强、热稳定性差物质 三、高效液相色谱仪 1. 主要流程 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 2. 主要品牌 主要包括waters、Agilent、岛津等。 大连依利特、北分瑞利、上海天美等国产品牌也得到了快速发展。 四、高效液相色谱仪主要部件 1. 高压输液系统 贮液罐 高压输液泵 梯度洗脱装置 一般为玻璃瓶 ，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑 料或聚醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每 个储瓶容积500~2000mL。 储液瓶位置要高于泵体 ，以保持一定的输液静 压差 ，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中 微量气体通过放空阀排出。 （2）高压输液泵 液相色谱仪的关键部件 ，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。输液泵 的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 基本要求 01 流量恒定 ，无脉动 ，并有较大的调节范围 （一般为1~10 mL/ min）; 02 能抗溶剂腐蚀 ； 5 03 有较高的输液压力 ，一般要求达到150~300×10 Pa。 （2）高压输液泵 常用的有 ：往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵。 往复式柱塞泵 ，使用最广泛的恒流泵 气动放大泵 ，以低压气体作用在大面积 气缸活塞上 ，传递到小面积液缸活塞 ， 利用压力放大获得高压 （3）梯度洗脱装置 梯度洗脱 ，载液中含有两种 （或更多）不同极性的溶剂 ，在分离过程中按一定程序连 续改变溶剂配比和极性 ，从而实现复杂样品的良好分离。 气相色谱 ，采用程序升温的方法 ，改善对宽沸程样品的分离 ； 液相色谱 ，采用梯度洗脱的方法 ，改善组分复杂样品的分离。 高压梯度 ( 内梯度 ) ：利用两台高压泵 ，将两种不同极性的溶剂按设定比例送入混合 室 ，混合后 ，进入色谱柱。 低压梯度 （外梯度） ：将两种或多种不同极性的溶剂按一定程序混合后 ，再用一台高 压泵输入色谱柱。 四、高效液相色谱仪主要部件 2. 进样系统 作用是将待分析样品引入色谱柱。包 括手动和 自动进样器。 （1）手动进样阀 （六通阀） 流路中为高压工作状态 ，通常使用耐高压 的六通阀进样装置 ，其结构如图所示。 （2）自动进样器 一种智能化、自动化的进样仪器 ，只需设置好进样参数、放入待检测样品即可完成 自 动进样过程。 组成包括 ： 进样臂 进样针 样品盘 清洗系统 驱动系统 控制系统 工作流程包括 ： 样品抽取 进样 洗针 由计算机控制 再进样 再抽样 3. 分离系统 （色谱柱） ：分析柱 +保护柱 色谱分离的核心 ，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱体为直型不锈钢管 ，柱长5 ～40cm，按内径大小可分为 ： 常规分析柱 （3.9mm、4.6mm） 窄径柱 （1.0mm、2.1mm） 毛细管柱 （0.2-0.5mm） 制备柱 （21.2mm、30mm、50mm） 半制备柱 （〉5mm，7.8mm、9.8mm、10mm） 发展趋势 ：减小填料粒度及柱径和柱长 ，以提高分析速度和柱效。 保护柱 （预柱） 一般在分析柱前装一根较短的保护柱 ，内填充物和分离柱完全一样。 01 可以防止来 自流动相和样 品中的不溶性微 粒对分析柱的堵塞 ； 02 使预柱先与流动相饱和 ，可除去样 品中能 与 固定相不可逆结合的物质 ，以保护较昂 贵的分析柱 ，延长使用寿命。 清洗 ：清洗保护柱时首先要拆下分析柱 ， 以免洗脱物进入分析柱。 4.检测系统 将流经样品池的液体试样的质量或浓度信号转变为电信号 。 （1）紫外检测器UVD 应用最广 ，对大部分有机化合物有响应。 特点 ： 灵敏度高 （10-9g/ mL）、线形范围宽 ； 流通池可做的很小 （容积 8μL）； 对流动相的流速和温度变化不敏感 ； 波长可选 ，易于操作 ； 可用于梯度洗脱。 （2）二极管阵列检测器 DAD 1024个二极管阵列 ，同时检测透过样品的所有波长 ，计算机快速处理 ，得到三维立体谱图。 特点 ： 以重叠加合技术解决重叠峰的计算问 3 题 ，检测出隐蔽的杂质 ； 2 选择适当波长消除干扰 ； 4 以在线方式对色谱峰进行光谱扫描 ； 选择波长使色谱 中每种组分 1 5 利用三维谱图(A–t-λ)比较对照定性 ， 都有最佳灵敏度和分离度 ； 可提高 tR 值定性的准确度。 一般认为DAD是液相色谱最有发展、最好的检测器 （3）荧光检测器FD 含有共轭π键体系的芳环或杂环有机物及其金属离子配合物等 ，受紫外光激发后 ，能发射 出比激发光波长长的荧光。 适合各种维生素、叶绿素、氨基酸和蛋 白质 、 酶、辅酶以及各种药物 、毒物和农药等 ，尤其 适于生物体组分的分析。或者与能发荧光的物 质衍生化反应后检测。 特点 ： 01 灵敏度高 ：比紫外高2-3个数量级 02 选择性好 （4）示差折光检测器RID UVD之外应用最多的通用型检测器。 利用连续测定参比池 （纯溶剂）与样品池 （洗脱液 + 组分 ）中溶液折射率的变化 （之差）来测量样品浓度。 差值与浓度呈正比。 四、高效液相色谱仪主要部件 （4）示差折光检测器RID 适用于分析无紫外吸收的有机物 （如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）。凝胶色谱必备检 测器 ，制备色谱中也经常使用。 特点 01 灵敏度低 （10-6g/mL） 02 折射率对温度和流速敏感 ，检测器需要恒温 ，不能用于梯度洗脱。 特点 ： 使用不便 ，需要配置高压 可检测挥发性低于流 无溶剂峰干扰 ，对温度变化不 氮气或空气 ，且实验中产 动相的任何样品； 敏感 ，适合梯度洗脱 ； 生废气有害。 1 2 3 4 5 流动相低温雾化和蒸发 ，对 通用型检测器 ，可与任何 热不稳定和挥发性物质也有 HPLC系统连接 ； 较高灵敏度 ； 广泛应用于不含发色团化合物的检测 ，如碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪 酸和氨基酸、表面活性剂、药物 ，并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下 检测未知化合物 。 ELSD与几种常用检测器之间的对比 检测器 ELSD UVD RID MS 有光吸收的 应用范围 通用 通用 通用 化合物 响应 质量相关 化学相关 折光度相关 质量相关 灵敏度 高 高 低 高 未知物检测 能 不能 能 能 流动相影响 不影响 本底影响 影响 不影响 /梯度 基线稳定性 好 较好 差 好 （6）电化学检测器 基于电化学原理和物质的电化学性质进行检测 ，有安培、极谱及电导等类型 ，适用于 测定具有电化学氧化还原性质及电导的化合物 ，如含硝基、氨基等有机化合物及无机 阴、阳离子等。电导检测器是离子色谱法中使用最广泛的检测器。 5. 信号处理与显示系统 信号放大、记录与数据处理 ，并显示测定结果。 色谱工作站 ：将各种控制功能与数据处理功能集于一体。 6. 辅助系统 （1）柱温箱 精确、稳定的控制色谱柱的使用温度 ， 对提高柱效 ，改善分离度 ，缩短保留时 间 ，保证分析结果的重现性 ，具有重要 的作用。对HPLC影响不大。 （2）脱气装置 流动相脱气的目的 ： 01 有利于高压泵准确输液 输液均匀准确 ，能减小脉动 ，提高保留时间及色谱峰面积的重现性 02 提高检测性能 防止流动相中气泡引起的尖峰 降低溶剂的紫外吸收本底 ，减少基线 保护色谱柱 减少死体积 ，防止气泡中氧等对柱填料的氧化 （2）脱气装置 超声脱气 一般能除去30%的溶解气体 ，有时还可能增加溶解量 ，与真 空脱气结合较好。 真空脱气 一种在负压状态下减少溶剂中气体溶解的方法。 减压过滤 实验室二次脱气处理常采用的有效方法。 在线脱气 在输液泵前对流动相进行连续脱气的装置 ，购买HPLC时一块 购买。多采用真空脱气技术。

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